Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

Lehrstuhl für Zell- und Molekularbiologie

 

 

 

Technologie Plattform

 

RNAi Screening

Wir entwickeln und verwenden Hochdurchsatz-Screening Methoden, um das Drosophila-Genom systematisch nach neuen Funktionen zu durchmustern. Dabei setzen wir vor allem RNA-Interferenz-Technologien ein, um zelluläre Prozesse besser zu verstehen und neue Komponenten von Signalwegen zu identifizieren.

  • RNA-Interferenz

     

    Der Einsatz und die Weiterentwicklung der RNA-Interferenz (RNAi) Technologie hat in den letzten Jahren maßgeblich dazu beigetragen, systematisch unbekannte Genfunktionen zu erforschen. Dabei werden Gentranskripte durch Einführung von homologen kurzen oder langen doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) gezielt abgebaut. RNAi, ursprünglich in C. elegans und Pflanzen entdeckt, wird heutzutage in vielen Modellsystemen, wie z.B. Drosophila oder menschlichen Zellen, eingesetzt. Mit der Entwicklung und Verfügbarkeit von genomweiten RNAi-Bibliotheken kann diese Methode in Kombination mit Hochdurchsatz-Screening-Verfahren verwendet werden, um das Genom nach einer Vielzahl von Zell- oder Organismus-basierten Phänotypen zu durchsuchen.

     


    RNAi Screening Ansätze
    (Bild: Boutros M. and Ahringer, J. (2008). The art and design
    of genetic screens: RNA interference. Nature Rev. Genet., 9:554-566.)

     

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  • RNAi Screening in Drosophila-Zellen

     

    RNAi kann in kultivierten Drosophila-Zellen durch Zugabe von in vitro-generierten doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) zum Kulturmedium induziert werden. Vorteile von Screens in Drosophila- gegenüber Säuger-Zellen sind die geringere genetische Redundanz und die hohe Effizienz von RNAi-Reagenzien. Mithilfe dieses Modellorganismus konnte unsere Arbeitsgruppe bereits eine Reihe von neuen Komponenten des Wnt-, JAK/STAT- und IMD-Signalwegs und anderer konservierter Signalnetzwerke identifizieren. RNAi-Experimente können sowohl genomweit als auch für Gene spezifischer funktioneller Gruppen durchgeführt werden. Mit zellbasierten Ansätzen können wir verschiedenste Phänotypen untersuchen, von der Überlebensfähigkeit der Zellen über Veränderungen in der Expression eines Reportergens bis zur multiparametrischen Analyse automatischer Mikroskopaufnahmen.

     

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  • Publikationen

 

RNAi Screening Ressourcen

Unsere Arbeitsgruppe hat langjährige Erfahrung mit zellbasiertem RNAi-Screening in Drosophila. Wir entwickeln und verbessern unsere Reagenzien und Methoden fortwährend. So haben wir eine neue genomweite Drosophila RNAi-Bibliothek (Heidelberg 2) mit einem optimierten Design entworfen und hergestellt. Mit dieser Bibliothek wurden bereits mehrere RNAi-Screens durchgeführt. Außerdem wurde sie für die Erstellung einer in vivo Drosophila-RNAi-Bibliothek (VDRC KK Bibliothek) verwendet. Dies ermöglicht es, zellbasierte und in vivo-Studien mit den gleichen RNAi-Konstrukten durchzuführen. Die Bibliothek wird von uns fortlaufend anhand neuer Genannotationen aktualisiert und im Hinblick auf Spezifität und Effizienz weiterentwickelt.

 

 

Bioinformatik-Tools

Wir haben verschiedene Bioinformatik-Anwendungen für das Design und die Analyse von Hochdurchsatz-RNAi-Screening-Experimenten entwickelt. Dazu gehören Software-Tools für Design und Evaluation von RNAi-Reagenzien (E-RNAi, NEXT-RNAi), eine benutzerfreundliche Web-Anwendung für die statistische Analyse von Screening-Daten (web cellHTS) und eine umfangreiche Datenbank für RNAi-Phänotypen (GenomeRNAi).

  • web cellHTS2 - web-basierte cellHTS2 Anwendung für statistische Analyse von Screening-Experimenten

     

    Hochdurchsatz-RNAi-Screens erzeugen große Datenmengen, die analysiert und annotiert werden müssen, um phänotypische Veränderungen identifizieren zu können. Die Web-Anwendung web cellHTS2 ist eine grafische Benutzeroberfläche für das Bioconductor / R-Paket cellHTS2 und führt den Anwender durch alle Konfigurationsschritte, die für die Analyse von Ein- oder Mehr-Kanal-Experimenten erforderlich sind. Sie bietet verschiedene Auswahloptionen zur Standardisierung und Normalisierung der Daten zur Annotation von Datensätzen und einen umfassenden HTML-Bericht zur Analyse der Screening-Daten an, einschließlich einer Rangliste der Hits. Sessions können gespeichert und für eine spätere Re-Analyse erneut geöffnet werden.

     

    Referenz: Pelz et al. (2010). web cellHTS2: a web-application for the analysis of high-throughput screening data. BMC Bioinformatics. 11:185. » Link zu PubMed

     

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  • GenomeRNAi - umfassende Datenbank für RNAi-Phänotypen von Drosophila und humanen Screens

     

    Die GenomeRNAi Datenbank enthält Phänotypen aus veröffentlichten RNAi-Screens in Drosophila melanogaster und Homo sapiens. Die Datenbank verbindet die beobachteten Phänotypen mit der Annotation der ausgeschalteten Gene und Informationen über die für das Experiment verwendeten RNAi-Reagenzien. Die Verfügbarkeit von Phänotypen aus Drosophila und humanen Screens ermöglicht auch Spezies-übergreifende Recherchen nach Phänotypen. Neben der Darstellung quantitativer Daten aus genomweiten Screens werden in GenomeRNAi auch Daten aus mikroskopischen Experimenten und ausgewählten Phänotypen aus veröffentlichten Screens zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus bietet die Datenbank eine aktualisierte Ressource von RNAi-Reagenzien, die für das Drosophila und das menschliche Genom verfügbar sind, sowie ihrer erwarteten Qualität.

     

    Referenz: Gilsdorf et al. (2010). GenomeRNAi: a database for cell-based RNAi phenotypes. 2009 update. Nucleic Acids Res., 38(Database issue):D448-52. » Link zu PubMed

     

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  • E-RNAi - web-basiertes Tool für das Design von RNAi-Konstrukten

     

    Eine strenge Qualitätskontrolle der langen doppelsträngigen RNAs (dsRNA) ist essentiell für die korrekte Bewertung von phänotypischen Daten. Hierbei werden potenzielle Off-Target-Effekte vorhergesagt, welche die Daten verfälschen können. Wir haben ein Web-basiertes Tool für die Bewertung und das Design von optimierten dsRNA-Konstrukten entwickelt.

     

    Referenz: Horn T. and Boutros M. (2010). E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38(Web Server issue):W332-9. » Link zu PubMed

     

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  • NEXT-RNAi - Software für das Design und die Evaluierung von genomweiten RNAi-Bibliotheken

     

    NEXT-RNAi ist eine Software für das Design und die Evaluierung von genomweiten RNAi-Bibliotheken. Diese Software führt alle Schritte von der Vorhersage von spezifischen und effizienten RNAi-Zielstellen bis hin zur Visualisierung der berechneten Reagenzien in ihrem genomischen Kontext durch. NEXT-RNAi ermöglicht das Design und die Bewertung von siRNAs sowie langen dsRNAs in einem Organismus-unabhängigen Kontext. Somit ermöglicht sie Designs für alle sequenzierten und annotierten Genome. Mindestvoraussetzung ist die Eingabe der gewünschten Ziel-Sequenzen und einer Off-Target-Datenbank. NEXT-RNAi implementiert mehrere Methoden, um die Qualität der Reagenzien vorherzusagen und bietet mehrere Optionen, wie das Design von unabhängigen RNAi-Reagenzien.

     

    Referenz: Horn et al. (2010). Design and evaluation of genome-wide libraries for RNAi screens. Genome Biol. 11(6):R61. » Link zu PubMed

     

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Allgemeine Informationen

  • Kontakt

     

    Lehrstuhlinhaber und Abteilungsleiter

    Prof. Dr. Michael Boutros

    Telefon: +49 621 383 9650

    E-Mail:

    Projektmanagement

    Dr. Ulrike Hardeland

    Telefon: +49 621 383 9648

    E-Mail:

    Anschrift

    Universität Heidelberg, Medizinische Fakultät Mannheim

    Lehrstuhl für Zell- und Molekularbiologie

    Ludolf-Krehl-Straße 13-17

    68167 Mannheim

    Deutschland

     

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  • Anfragen zu RNAi-Reagenzien und Screening

     

    RNAi Reagenzien der neuen Drosophila dsRNA-Bibliothek (Heidelberg 2) können bei uns angefragt werden. Wir haben eine genomweite RNAi-Bibliothek sowie Teilbibliotheken entwickelt und können diese sowie Sets für ausgewählte Zielgene weiter geben. Bitte kontaktieren Sie uns bezüglich Kosten und weiteren Informationen. Bei Interesse, einen Screen mit uns durchzuführen, benötigen wir bestimmte Informationen, um festzustellen, ob wir ein solches Screening-Experiment in Kollaboration durchführen können. Die meisten Hochdurchsatz-Screens haben spezifische Anforderungen im Hinblick auf Assay-Entwicklung und Screening-Verfahren.

    Das unten stehende Formular hilft uns, den biologischen Hintergrund des Screens und die technischen Anforderungen zu verstehen. Bitte senden Sie das ausgefüllte Formular an .

    Sie können uns gerne kontaktieren, um Ihre Screening-Idee zu diskutieren.

     

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Letzte Änderung: 15.05.2014