Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

Lehrstuhl für Zell- und Molekularbiologie

 

 

 

Wnt Signalwege in Zebrafisch

Dr. Matthias Carl

 

Der Wnt Signalweg ist in einer Vielzahl von Prozessen involviert, zu denen neben der Entstehung von Krankheiten wie zum Beispiel Krebs auch die frühe Embryonalentwicklung gehören.

Wir sind besonders an der Entwicklung des Gehirns von Vertebraten interessiert. Um herauszufinden, welche genetischen Kaskaden der Gehirnentwicklung zu Grunde liegen, analysieren wir den Zebrafisch (Danio rerio). Das Gehirn der Vertebraten ist äusserst komplex aufgebaut und weist eine Reihe von anatomischen und funktionalen Asymmetrien auf. Die Kernfrage, welche genetischen Prozesse der Entwicklung dieser Asymmetrien zu Grunde liegen, ist allerdings bislang weitgehend ungeklärt. Die Fehlentwicklung solcher Strukturen im Menschen können erhebliche Konsequenzen haben und zum Beispiel zu Schizophrenie und Depressionen führen.

 

 

Wnt und Neuralentwicklung

Mindestens zwei Strukturen im Vorderhirn vieler Vertebraten sind asymmetrisch und lassen sich im Fisch besonders gut sichtbar machen: der Pineal Komplex und die Habenulae. Die Habenulae verbinden das Vorderhirn mit dem Mittelhirn und befinden sich auf beiden Seiten des dorsalen Diencephalons, wobei die linke Seite mehr Neuropil ausbildet. Der Pineal Komplex besteht aus dem medial geformten Pinealorgan und einigen sogenannten Parapinealzellen, die vom Pinealorgan aus auf die linke Seite des dorsalen Diencephalons migrieren. Diese senden Projektionen zur linken Habenula. Beide Habenulae ihrerseits senden Projektionen ins ventrale Mittelhirn, wo sie den sogenannten interpeduncular Nucleus in einer Art und Weise innervieren, dass die links-rechts Asymmetrie im dorsalen Diencephalon in eine dorso-ventrale Asymmetrie umgewandelt wird.

 


In vivo time lapse Film einer neuen transgenen Fischlinie, die GFP im Neuralnetz der Habenula zeigt. Aufnahmen wurden mit einem konfokalen 2-Photonen Mikroskop im Nikon Imaging Center Heidelberg gemacht – Carlo Beretta unter Mithilfe von Nicolas Dross, Pete Bankhead und Ulrike Engel. Dorsale Ansicht, vorne ist links.

 

Wir konnten kürzlich zeigen, dass das Axin1 Gen, ein bekannter Inhibitor des Wnt/b-catenin Signalweges, wichtig für die Etablierung dieser Asymmetrien im Gehirn ist. Wir kombinieren nun Molekularbiologie, Genetic und advanced Imaging, um herauszufinden wo, wann und wie der Wnt Signalweg in der Etablierung von Gehirn Asymmetrien agiert. Zu diesem Zweck analysieren wir hauptsächlich die Gehirn Asymmetrien in Zebrafisch Mutanten, die defekte Gene des Wnt/b-catenin Signalweges im Erbgut aufweisen. Des Weiteren werden die Studien durch die zeitlich regulierte und direktionierte Fehlexpression von Genen in Kombinationen von wildtyp, mutanten und transgenen Fischen komplettiert. Außerdem analysieren wir neue Gene des Wnt Signalweges und deren potentielle Beteiligung in der Etablierung von Asymmetrien im Gehirn.

 


In vivo time lapse Film, der die sich entwickelnde Habenula zeigt. Konfokale Aufnahmen unter Verwendung von GFP Filter und DIC Beleuchtung. Dorsale Ansicht, vorne ist oben links (Kollaboration mit Soojin Ryu).


3-D Rekonstruktion der sich entwickelnden Habenula am Tag zwei der Entwicklung.

 

 

Wnt und Entwicklung der Körperachse

Über eine Zeitspanne von ca. 350 Millionen Jahren haben sich ungefähr 25.000 Fischarten entwickelt. Damit sind Fische die verschiedenartigsten Vertebraten überhaupt. Die beiden am häufigsten im Labor verwendeten Fisch-Modellorganismen sind neben dem zuvor erwähnten Zebrafisch die Medakafische (oryzias latipes). Während die beiden Fische ähnliche Morphologien aufweisen, sind sie evolutionär gesehen weit voneinander entfernt, was uns die einzigartige Möglichkeit eröffnet, vergleichende Studien durchzuführen. Diese sind essentiell, um die Mechanismen, die Entwicklung und Evolution zu Grunde liegen, verstehen zu lernen.
Eine häufig genutzte Methode Gene zu identifizieren, die für die Entwicklung eines Embryos wichtig sind, ist die Einführung zufälliger Mutationen in das Genom. Führt dies zu morphologischen Veränderungen von Interesse, wird das mutierte Gen isoliert und die genaue Funktion während des betreffenden Entwicklungsprozesses studiert. Solche sogenannten Mutagenese-Screens wurden in der Vergangenheit häufig und erfolgreich im Zebrafisch angewendet. Kürzlich hat man auch im Medakafisch begonnen zu screenen und vielleicht vom evolutionären Standpunkt aus nicht überraschend zeigen einige der identifizierten Mutanten Phänotypen, die man bisher von keinem anderen Vertebraten her kannte. Die mutierten Gene der meisten dieser Mutanten erwarten ihre Identifikation.
Wir sind speziell an einer Gruppe von Medaka Mutanten interessiert, deren Gemeinsamkeit ist, daß sich keine Schwanzbereiche ausbilden, während die Kopfentwicklung nicht betroffen zu sein scheint.

 


stummelschwanz Mutanten (oben) fehlt der Schwanz.

 

In einer Kollaboration wurde eine Mutante aus dieser Gruppe kürzlich von der Arbeitsgruppe um Hiroyuki Takeda identifiziert. Diese Mutanten tragen eine Punktmutation im FGF-Rezeptor1 Gen, was dazu führt, daß die Schwanzentwicklung stark betroffen ist. Im Gegensatz hierzu spielt im Zebrafisch dieses Gen nur eine Rolle in der Entwicklung der Mittel-/Hinterhirn Grenze. Diese Phänotypen sind mit der unterschiedlichen Genexpression dieses Rezeptors in verschiedenen Bereichen des Zebrafisches verglichen mit der des Medakafisches konsistent. Dies ist ein hervorragendes Beispiel von evolutionärer Divergenz der Notwendigkeit eines einzelnen Rezeptors, welches höchstwahrscheinlich auf die unterschiedliche Regulation der regionalen Genexpression zurückzuführen ist.
Momentan analysieren wir vier weitere Mutanten aus dieser Gruppe mit genetischen, molekularen und imaging Techniken. Dies wird es uns erlauben, die Funktion der mutierten Gene herauszufinden sowie die mutierten Gene zu identifizieren. Nach der Identifikation des Gens werden wir die Funktion der homologen Gene im Zebrafisch inaktivieren und miteinander in diesen zwei evolutionär weit voneinander entfernten vertebraten Modellsystemen vergleichen.

Unsere Arbeit hat kürzlich zur Identifikation eines in einer der Mutanten mutierten Gens geführt und es stellte sich heraus, daß es im Wnt/b-catenin Signalweg fungiert. Wir sind jetzt dabei eine genaue phänotypische Charakterisierung vorzunehmen und unsere funktionsvergleichenden Studien aufzunehmen. Unsere vergleichenden Studien werden es uns erlauben zwischen Spezies spezifischen und konservierten Genfunktionen zu unterscheiden, die wichtig für die Ausbildung der hinteren Körperachse sind.

 

 

Stellenangebote:

Interessenten auf jedem Karrierelevel können sich gerne bei uns bewerben. Voraussetzung ist das Erbringen der eigenen Personalkosten über Stipendien, etc.

 

 

Gruppe:

Dr. Matthias Carl, Gruppenleiter

Luca Guglielmi, Doktorand

Sara Asgharpour, Doktorandin

 

Ehemalige Gruppenmitglieder:

Nesrin Mwafi, Doktorandin

Alessio Paolini, Doktorand

Tillmann Rusch, Praktikant

Aysu Kök, Praktikantin

Raquel Jacinto, Doktorandin

Krystyna Zawieja, Technische Angestellte

Carlo Beretta, Doktorand

Ulrike Hüsken, Doktorandin

Kirsten Seufert, Laborhilfskraft

Christian Altbürger, Praktikant

Elke von Ochsenstein, Technische Angestellte

Shiqi Zhang, Praktikantin

Christina Keiner, Praktikantin

Ann-Christin Mentzer, Praktikantin

Jacquline Siu, Praktikantin

Griffin Hartmann, Praktikant

Natalja Mamaeva, Praktikantin

Irena Brinkmann, Master-Studierende

 

Ausgewählte Referenzen:

Hüsken, U., Stickney, H.L., Gestri, G., Bianco, I.H., Faro, A., Young, R.M., Roussigne, M., Hawkins, T.A., Beretta, C.A., Brinkmann, I., Paolini A., Jacinto, R., Albadri, S., Dreosti, E., Tsalavouta, M., Schwarz, Q., Cavodeassi, F., Barth, A.K., Wen, L., Zhang, B., Blader, P., Yaksi, E., Poggi, L., Zigman, M., Lin, S., Wilson, S.W., and Carl, M. (2014). Tcf7l2 is required for left-right asymmetric differentiation of habenular neurons. Current Biology 24(19):2217-2227.

Dross, N., Beretta, C.A., Bankhead, P., Carl, M., and Engel, U. (2014). Zebrafish Brain Development Monitored by Long-Term in Vivo Microscopy: A Comparison Between Laser Scanning Confocal and 2-Photon Microscopy. Book chapter in: Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue, Springer Science.

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Yokoi, H., Shimada, A., Carl, M., Takashima, S., Kobayashi, D., Narita, T., Jindo, T., Kimura, T., Kitagawa, T., Kage, T., Sawada, A., Naruse, K., Asakawa, S., Shimizu, N., Mitani, H., Shima, A., Tsutsumi, M., Hori, H., Wittbrodt, J., Saga, Y., Ishikawa, Y., Araki, K., and Takeda, H. (2007). Mutant analyses reveal different functions of fgfr1 in medaka and zebrafish despite conserved ligand-receptor relationships. Dev. Biol. 304: 326-337.

 

 

Kollaborationspartner:

Francesco Argenton, University Padova, Italy

Patrick Blader and Myriam Roussigne, Université de Toulouse, France

Michael Boutros, DKFZ, Heidelberg, Germany

Filippo Del Bene, Curie Institute, Paris, France

Ulrike Engel, Nikon Imaging Center Heidelberg, Germany

Marika Kapsimali, Ecole Normale Superieure Paris, France

Cheol-Hee Kim, Korea

Suat Özbek, Heidelberg University, Germany

Soojin Ryu, MPI Heidelberg, Germany

Veit Riechmann, Heidelberg University, Germany

Sven Sauer, Heidelberg University, Germany

Steffen Scholpp, KIT, Karlsruhe

Christian Schultz, Heidelberg University, Germany

Herbert Steinbeisser laboratory, Heidelberg University, Germany

Rolf-Detlef Treede, Heidelberg University, Germany

Steve Wilson, UCL London, UK

Jochen Wittbrodt, Heidelberg University, Germany

 

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Letzte Änderung: 03.07.2015